◇“在我看來，此次嵌合猴成果對(duì)生命醫(yī)學(xué)的重要性不亞于克隆猴，是非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作的一個(gè)里程碑?！?/span>
◇胚胎干細(xì)胞可以體外無限自我復(fù)制，對(duì)于制作攜帶疾病基因的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來說，胚胎干細(xì)胞嵌合體技術(shù)有著其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)
◇“我們的目標(biāo)是盡快做出幾種腦疾病的猴模型，爭(zhēng)取在5年內(nèi)向世界證實(shí)猴模型對(duì)醫(yī)藥研發(fā)有用。”
◇“已經(jīng)有一些跨國(guó)公司聯(lián)系到我們，希望以后在上海建立醫(yī)藥CRO公司，我們做出來猴模型可以給他們應(yīng)用，這是一個(gè)未來產(chǎn)業(yè)?！?/span>
2018年1月25日，克隆猴“中中”和“華華”以封面文章形式登上國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》，標(biāo)志著體細(xì)胞克隆技術(shù)首次在靈長(zhǎng)類動(dòng)物上實(shí)現(xiàn)。
五年后，由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（以下簡(jiǎn)稱腦智卓越中心）牽頭的研究再次登上《細(xì)胞》封面，這一次，他們帶來了“嵌合猴”。
這是世界上首個(gè)用胚胎干細(xì)胞構(gòu)建的高比例嵌合猴。團(tuán)隊(duì)將A猴的胚胎干細(xì)胞注射到B猴的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中，再將嵌合胚胎植入C猴體內(nèi)代孕，最終誕生的小猴由A猴胚胎干細(xì)胞和B猴胚胎細(xì)胞共同分化而來，供體胚胎干細(xì)胞的占比高達(dá)70%左右。
“在我看來，此次嵌合猴成果對(duì)生命醫(yī)學(xué)的重要性不亞于克隆猴，是非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作的一個(gè)里程碑?！敝袊?guó)科學(xué)院院士、中國(guó)科學(xué)院腦智卓越中心學(xué)術(shù)主任蒲慕明接受《瞭望》新聞周刊記者采訪表示，胚胎干細(xì)胞可以體外無限自我復(fù)制，對(duì)于制作攜帶疾病基因的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來說，胚胎干細(xì)胞嵌合體技術(shù)有著其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
嵌合猴是個(gè)大臺(tái)階
“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)。鼠類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型之所以對(duì)生命醫(yī)學(xué)作出巨大貢獻(xiàn)，關(guān)鍵在于制作出了帶有特定疾病基因的小鼠品系?！贝舜窝芯康闹鹘鞘呛?，但蒲慕明從一只獲得諾貝爾獎(jiǎng)的小鼠講起。
小鼠品系，是經(jīng)過長(zhǎng)期繁殖和選擇得到，同一品系的小鼠在遺傳特征和生理特性上高度一致，做藥物實(shí)驗(yàn)時(shí)互為對(duì)照，便于排除干擾因素。
那么，帶有特定疾病基因的小鼠品系是怎么做出來的呢？
如果對(duì)一批小鼠的受精卵進(jìn)行基因打靶，改變基因組中特定基因或者序列，由于打靶程度和靶點(diǎn)不完全相同，各個(gè)受精卵的基因也不同，并不能得到相同的疾病鼠。
蒲慕明介紹，美國(guó)分子遺傳學(xué)家馬里奧·卡佩奇想到，可以把小鼠A和小鼠B的受精卵在體外發(fā)育到囊胚期。囊胚期是指卵子剛剛受精但尚未種植到子宮的階段，它由尚未分化的外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)組成，外胚層未來會(huì)分化為胎盤，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)則將分化為胎兒個(gè)體，具有發(fā)育全能性。
首先，對(duì)來自A的囊胚，馬里奧·卡佩奇團(tuán)隊(duì)首先把其中的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)里的細(xì)胞提取出來建成胚胎干細(xì)胞系，通過基因打靶改變其特定基因。篩選出其中打靶準(zhǔn)確的細(xì)胞大量擴(kuò)增，從而得到一批完全相同的、基因改變的胚胎干細(xì)胞。
第二，把這些來自A的胚胎干細(xì)胞注射到B的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中，這樣就形成了一個(gè)嵌合胚胎，其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)既有來自A的，也有來自B的。
第三，將嵌合胚胎植入小鼠C體內(nèi)孕育，最終誕生嵌合小鼠。小鼠C并不對(duì)嵌合產(chǎn)生影響，只起到代孕作用。
“最關(guān)鍵的是嵌合體中兩種細(xì)胞的比例，供體細(xì)胞占比要足夠大才能改變嵌合動(dòng)物，這一點(diǎn)在鼠上做成了。”蒲慕明說。
胚胎干細(xì)胞嵌合技術(shù)1984年在小鼠上誕生后，迅速成為幫助科學(xué)家確認(rèn)單個(gè)基因在人類健康和疾病中作用的一大利器，帶來生命醫(yī)學(xué)界的重大革命，對(duì)這項(xiàng)技術(shù)作出重要貢獻(xiàn)的三位科學(xué)家馬里奧·卡佩奇、馬丁·埃文斯、奧利弗·史密西斯因此在2007年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。2008年，科學(xué)家在大鼠上也實(shí)現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞嵌合。
遺憾的是，胚胎干細(xì)胞嵌合技術(shù)在靈長(zhǎng)類上的研究進(jìn)展十分緩慢。由于嚙齒類與靈長(zhǎng)類存在巨大差異，一些人類疾病并不能在嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上實(shí)現(xiàn)。猴作為與人類親緣最近的動(dòng)物，被視為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的最佳選擇，但尚未有技術(shù)能制作出猴品系，實(shí)驗(yàn)猴的成熟應(yīng)用僅限于藥物安全實(shí)驗(yàn)。
2012年，美國(guó)的靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)室曾得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論：猴的胚胎干細(xì)胞不能形成嵌合體。之后幾年，中國(guó)科學(xué)院院士、昆明理工大學(xué)季維智團(tuán)隊(duì)取得重要進(jìn)展，他們通過研究得到過流產(chǎn)或出生的胚胎干細(xì)胞嵌合猴，嵌合比例為0.1%～4.5%。
現(xiàn)在，世界首只胚胎干細(xì)胞高比例嵌合猴誕生，向世界證實(shí)了猴模型的可能性。2023年11月9日，《細(xì)胞》以封面文章形式發(fā)表題為《高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的出生存活嵌合體猴》的研究成果，由中國(guó)科學(xué)院腦智卓越中心、上海腦科學(xué)與類腦研究中心劉真研究組，中國(guó)科學(xué)院腦智卓越中心非人靈長(zhǎng)類研究平臺(tái)孫強(qiáng)研究團(tuán)隊(duì)和中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院Miguel A. Esteban（米格爾·埃斯特班）研究組合作完成，獲得了科技部、中國(guó)科學(xué)院、上海市、自然科學(xué)基金委的資助。
審稿人評(píng)價(jià)，該研究結(jié)果是非凡的，因?yàn)樘峁┝藦?qiáng)大的證據(jù)證實(shí)靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞可以產(chǎn)生高比例的嵌合體動(dòng)物，這在之前沒有得到明確證實(shí)。
解決三大難題，嵌合程度高達(dá)70%
記者采訪了解到，團(tuán)隊(duì)為40只代孕母猴移植了有明顯嵌合的囊胚，共獲得4只流產(chǎn)的胚胎和6只出生的小猴。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中1只流產(chǎn)胚胎和1只出生小猴有明顯嵌合，前者的胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)比例約20%，后者的胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)比例高達(dá)70%。
團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，供體胚胎干細(xì)胞可以跟受體胚胎細(xì)胞同步分化到猴的各種細(xì)胞譜系中。其中，腦細(xì)胞的嵌合程度最高，達(dá)到90%?！斑@意味著這項(xiàng)技術(shù)對(duì)于腦疾病的研究潛力巨大?！逼涯矫髡f。
“不僅如此，嵌合猴的胎盤組織和生殖細(xì)胞中也有胚胎干細(xì)胞的高比例貢獻(xiàn)?！眲⒄嬲f，胎盤組織和生殖細(xì)胞在胚胎發(fā)育和重編程過程中非常特殊。其中，胎盤組織由外胚層發(fā)育而來，小鼠胚胎干細(xì)胞幾乎不會(huì)貢獻(xiàn)到胎盤組織，靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞可能具有不同于嚙齒類的獨(dú)特的發(fā)育全能性特征。
生殖細(xì)胞發(fā)育過程中要經(jīng)歷更加劇烈的表觀重編程，生殖細(xì)胞的高比例貢獻(xiàn)表明供體基因可以傳遞給下一代，這對(duì)后續(xù)基于該技術(shù)的遺傳修飾實(shí)驗(yàn)猴模型構(gòu)建至關(guān)重要。
世界首只胚胎干細(xì)胞高比例嵌合猴為什么能成功誕生？劉真及團(tuán)隊(duì)告訴記者，主要是在前人研究的基礎(chǔ)上解決了三個(gè)難題：
一是獲得有高效發(fā)育潛能的猴胚胎干細(xì)胞。小鼠的胚胎干細(xì)胞有幼稚態(tài)和始發(fā)態(tài)兩種形態(tài)，其中幼稚態(tài)的發(fā)育全能性更強(qiáng)。但常規(guī)培養(yǎng)的靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞與小鼠胚胎干細(xì)胞的始發(fā)態(tài)更接近，一定程度上表明，靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞的發(fā)育全能性天然更弱。
“培養(yǎng)液是關(guān)鍵?！眲⒄娼榻B，團(tuán)隊(duì)廣泛研究各類用于干細(xì)胞的培養(yǎng)液后，建立了處于6種不同培養(yǎng)體系下的食蟹猴胚胎干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)5iLAF、4CL和PXGL培養(yǎng)體系下的干細(xì)胞具有較高的多能性，而且4CL培養(yǎng)體系下的干細(xì)胞具有更好的傳代穩(wěn)定性和基因組穩(wěn)定性。
二是解決胚胎干細(xì)胞注入后快速凋亡的問題。由于胚胎發(fā)育條件和干細(xì)胞培養(yǎng)條件不同，團(tuán)隊(duì)需要避免胚胎干細(xì)胞注射入受體胚胎后快速凋亡。
中國(guó)科學(xué)院腦智卓越中心聯(lián)合培養(yǎng)博士曹靜介紹，團(tuán)隊(duì)選用4CL培養(yǎng)液下的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行猴胚胎注射實(shí)驗(yàn)，通過測(cè)試不同培養(yǎng)液和培養(yǎng)時(shí)間的組合，發(fā)現(xiàn)4CL培養(yǎng)液與胚胎培養(yǎng)液1:1混合可以得到最適合嵌合胚胎的培養(yǎng)條件。
三是嚴(yán)謹(jǐn)準(zhǔn)確地檢測(cè)出嵌合比例。為了追蹤胚胎干細(xì)胞，按照領(lǐng)域內(nèi)常用的方法，團(tuán)隊(duì)早在胚胎干細(xì)胞植入胚胎前就將其標(biāo)記上了綠色熒光蛋白，由胚胎干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出熒光。
除此之外，團(tuán)隊(duì)建立了包含PCR擴(kuò)增（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）、微衛(wèi)星親子鑒定、基因組單核苷酸多態(tài)性深度測(cè)序、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、綠色熒光蛋白檢測(cè)、免疫熒光檢測(cè)的一系列嚴(yán)格的嵌合體分析流程。劉真舉例說，小猴出生后，團(tuán)隊(duì)首先用微衛(wèi)星親子鑒定（類似人的親子鑒定）來確定嵌合猴確實(shí)攜帶來自胚胎干細(xì)胞的信息，隨后用基因組單核苷酸多態(tài)性深度測(cè)序解析嵌合猴的基因組信息，從而區(qū)分胚胎干細(xì)胞和原本胚胎細(xì)胞的比例。
此項(xiàng)研究嚴(yán)格遵守生物倫理規(guī)范，所有實(shí)驗(yàn)均符合國(guó)際干細(xì)胞研究學(xué)會(huì)的研究指南，并經(jīng)過中國(guó)科學(xué)院腦智卓越中心倫理委員會(huì)審核。
規(guī)模化應(yīng)用很快到來
鼠類模型有很多優(yōu)勢(shì)，比如繁殖快、體積小、很多基因編輯的方法也很成熟，但其與人類的區(qū)別較大。以腦疾病研究為例，鼠腦沒有人腦那樣的溝回和腦區(qū)，很難用鼠類模型模擬神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括但不限于孤獨(dú)癥、老年癡呆癥、帕金森癥等。如果能用猴制作出成熟的疾病模型，那么當(dāng)下的許多疑難雜癥研究治療有可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)機(jī)。
蒲慕明介紹，針對(duì)不同疾病，有不同的模型制作方法。2018年，中國(guó)科學(xué)院腦智卓越中心制作出了世界首個(gè)體細(xì)胞克隆猴，次年利用該技術(shù)制作出了5只腦疾病體細(xì)胞克隆猴，目前正與中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所合作開發(fā)治療腦疾病創(chuàng)新藥。2016年國(guó)際上第一個(gè)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)做出來的孤獨(dú)癥猴也出自這個(gè)研究團(tuán)隊(duì)。
“現(xiàn)在我們開發(fā)了七八種不同的猴模型，但這些模型不是最好的，因?yàn)槊恐缓锏膫€(gè)體差異太大。胚胎干細(xì)胞嵌合技術(shù)有望得到?jīng)]有個(gè)體差異的疾病猴，從而推動(dòng)猴模型走向規(guī)?；瘧?yīng)用?！逼涯矫髡f。
從技術(shù)突破到真正建立疾病猴模型，需要多長(zhǎng)時(shí)間？
猴模型的制作比鼠模型困難很多。僅從時(shí)間周期來看，小鼠20天出生，2個(gè)月性成熟，既可以傳代也可以用于研究。猴懷胎需要5個(gè)半月，性成熟則需要5年甚至更久。
猴模型的制作除了研發(fā)和構(gòu)建模型技術(shù)外，還需要針對(duì)猴模型重新建立飼養(yǎng)空間、行為范式、測(cè)試體系等。
劉真介紹，下一步將對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因打靶，也就是讓猴攜帶上特定的疾病基因，這是制造疾病猴模型的關(guān)鍵一步。此次成果證實(shí)了胚胎干細(xì)胞高比例嵌合猴能做出來，即理論上基因打靶后再按照現(xiàn)在這個(gè)嵌合步驟就能做出疾病猴模型，但實(shí)際能不能、會(huì)遇到什么問題還需要實(shí)踐去驗(yàn)證。此外，中心有其他團(tuán)隊(duì)關(guān)注相關(guān)的表型分析、疾病測(cè)試、藥物干預(yù)和認(rèn)知研究。
“我們的目標(biāo)是盡快做出幾種腦疾病的猴模型，爭(zhēng)取在5年內(nèi)做出一些創(chuàng)新藥來，向世界證實(shí)猴模型對(duì)醫(yī)藥研發(fā)有用。”蒲慕明告訴記者，屆時(shí)，基礎(chǔ)研究團(tuán)隊(duì)的成果將向下游推廣，憑借猴模型上的獨(dú)家優(yōu)勢(shì)吸引全球資源，“已經(jīng)有一些跨國(guó)公司聯(lián)系到我們，希望以后在上海建立醫(yī)藥CRO（醫(yī)藥研發(fā)外包）公司，我們做出來猴模型可以給他們應(yīng)用，這是一個(gè)未來的產(chǎn)業(yè)。”
來源：《瞭望》2024年第03期
原標(biāo)題：從克隆猴到嵌合猴，靈長(zhǎng)類模型還有多遠(yuǎn)？
作者：《瞭望》新聞周刊記者?張建松?董雪
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